2-苯酒精（2-PE）是一种具有玫瑰花香味的脂肪醇，因其具有温顺的、精雅的玫瑰花般的气息，被觉得是食物和化妆品工业中的要紧香料因素。此外，它还可被用作合成其他香料或药死字合物的底物，如苯乙酸、苯乙醛和乙酸苯乙酯等。在自然界中，2-PE主要从玫瑰、茉莉花、番茄和荞麦等花草和植物组织的精油中索取。关联词，由于这些植物中的2-PE浓度荒谬低沈先生 探花，因此萃取经由荒谬复杂，况且花草的成绩也会受到天气、植物病害和贸易甩手等因素的影响。从玫瑰或其他植物的精油中索取自然2-PE的老本荒谬高，如索取自然2-PE的原料玫瑰精油海外阛阓的价钱就已高达3500~6000好意思元/kg。整个这些因素皆是导致自然2-PE的供应不及和老本过高的主要原因。
咫尺，全国阛阓上2-PE的年产量如故荒芜10 000 t，其主要坐褥门径是苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢法，海外阛阓上苯-环氧乙烷合成法居品占40%，氧化苯乙烯加氢法居品占60%。苯-环氧乙烷合成法坐褥的居品所含微量杂质不同，香气相反较大，大多不成用于香料，国内主门径受氧化苯乙烯加氢法。化学合成经由一般在高温、高压、强酸或强碱环境等恶劣条目下操作，会产生很多不良副产物，如乙苯、苯乙烯等，这不仅增多了卑劣老本，而且严重裁汰了2-PE的级别。对环保工艺日益增长的需求以及消费者对“自然”居品的偏好极地面刺激了香料和香料生物坐褥工艺的发展。很多具有2-PE坐褥材干的野生型菌株如故被分离并决然，其中大多数是真核生物，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）等。关联词，除了叶微杆菌（Microbacterium foliorum）、变形杆菌（Proteus vulgaris）和嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）外，很少有原核生物不错合成2-PE。生物转化经由常常在温顺的条目下进行，产物采用性高。此外，凭证好意思国食物和药物料理局以及相干的欧洲法令章程，如果用于坐褥经由的底物是自然的，则生物坐褥的2-PE会被觉得是“自然的”。咫尺，利用生物转化法坐褥2-PE已取得紧要阻碍。其中，合成生物学遵循于构建“非自然存不才的生化系统”，通过利用不同的生物元件，构建全新的菌株代谢汇集，从而高效合成东谈主类需求的代谢产物。通过使用有用的代谢工程战略不错诊治不同酶的基因抒发水平，以找到均衡，进而改善代谢通量并减少代谢包袱或其他反作用，从而将低价的葡萄糖或苯丙氨酸转化为高附加值的2-PE。本文作家全面综述2-PE合成的多样途径、调控机制以及普及2-PE产量的战略。同期，磋议了农工烧毁物四肢2-PE坐褥原料的利用和原位产物分离（ISPR）技巧的应用。
2 微生物中2-苯酒精的生物合成旅途咫尺，2-PE的生物合成主要有3种途径（图1）。其中，艾氏途径是最要紧的途径，在氮限条目下，L-苯丙氨酸（L-Phe）通过三步酶催化反应转化为2-PE。第2个途径是莽草酸途径，它所以葡萄糖等碳水化合物为底物重新合成2-PE。关联词，这种复杂的反应途径具有热烈的反馈遏制作用，导致2-PE坐褥效率低下。临了一种是苯乙胺途径，它与艾氏途径肖似，在植物中起着更要紧的作用。
图1 2-苯酒精的生物合成途径
EMP—糖酵解途径；HMP—磷酸戊糖途径；AT—转氨酶；PDC—苯丙酮酸脱羧酶；ADH—醇脱氢酶；AAAD—芳醇族氨基酸脱羧酶；MAO—单胺氧化酶；PAAS—苯乙醛合酶
2.1 艾氏途径艾氏途径往常存在于多样微生物中，它厚爱将支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）、芳醇族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和含硫氨基酸（蛋氨酸）解析代谢成相应的杂酸或高等醇。该途径率先是由艾氏（Ehrlich）描写的，因此用其名字进行定名。如图1所示，在该途径中，L-Phe最先被转氨酶（ARO8，ARO9，BAT1/TWT1和BAT2/TWT2）氨基化为苯丙酮酸，然后被苯丙酮酸脱羧酶（YDR380w/ARO10，YDL080C/THI3，PDC1，PDC5和PDC6）脱羧为苯乙醛，临了通过醇脱氢酶（ADH1，ADH2，ADH3，ADH4和ADH5）或甲醛脱氢酶（SFA1）收复为2-PE。
在艾氏途径中重要酶的抒发水平会受到相干转录因子的调控和氮调控战略的诊治。其中，Zn2CyS6眷属转录激活因子ARO80是2-PE合成中最要紧的调控因子之一。研究收尾标明，ARO80不错与aro9和aro10的启动子组成性联接，在芳醇族氨基酸的存不才，ARO80不错激活aro9与aro10的抒发。在芳醇族氨基酸四肢独一氮源的条目下，芳醇族氨基酸通过氨基酸通透酶Gap1参预细胞，Aro80接管芳醇族氨基酸的请示信号后与aro9和aro10基因启动子上的CCG重迭序列联接，激活艾氏途径重要酶基因的抒发。除ARO80之外，与碳代谢研究的锌簇卵白CAT8相通是艾氏途径中一个要紧的激活因子，它在诊治受芳醇醇影响的基因（如Adh2）的相反抒发中起着要紧作用。同期，CAT8的抒发还会受到具有两个Cys2His2锌指结构的转录因子MIG1的调控，CAT8的过抒发或MIG1的缺失不错有用增多aro9和aro10的转录，从而使更多的苯丙氨酸转化为苯乙醛。
此外，艾氏途径中重要酶的抒发水平也会受到氮源种类的影响。当培养基中存在优选氮源（铵或天冬酰胺）时，氮解析代谢物禁止（NCR）的全局氮调控会严重甩手酵母使用非优选氮源（亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和脯氨酸）的材干。从分子生物学的角度来看，咫尺如故决然出4个不错影响NCR明锐基因的转录和翻译水平的GATA因子，其中包括两个激活因子（Gln3和Gat1/Nil1）以及两个遏止因子（Dal80/Uga43和Gzf3/Nil2/Deh1）。当优选氮源存在时，Gln3和Gat1被阻隔在细胞质中，无法参与靶基因的转录调控。当无优选氮源存在时，Gln3和Gat1就会出动到细胞核中，从而激活NCR明锐基因的抒发［图2(a)］。另外，Gln3还会受到pr病毒样URE2卵白的负调控，捎带失活URE2的细胞即使在优选氮源存在时也大约利用非优选氮源。此外，雷帕霉素也不错影响到氮调控，经过雷帕霉素处理不错模拟氮饥饿环境，从而导致Gln3和Gat1的执意位和NCR明锐基因的激活。研究标明，影响艾氏途径中重要酶抒发水平的转录调控系统和NCR诊治呈现复杂的互补诊治和部分本人诊治，ARO80是ARO80靶启动子招募GATA因子所必需的，而GATA因子也可通过氨基酸通透性的转录调控障碍影响ARO80的活性，两者之间相互配合共同调控艾氏途径中重要酶的抒发。此外，芳醇醇的合成还会受到细胞密度的正反馈诊治。一般来说，由于芳醇醇是群体感应分子，不错使酵母在氮饥饿的情况下更动为丝状体，因此高密度的细胞每个细胞不错产生更多的芳醇醇。转录组分析表示，在高细胞密度时，aro9和aro10的转录水平显耀增强。图2(b)表示了通过艾氏途径合成2-PE的总体调控图，但其调控机制尚不明晰。
图2 苯酒精生物合成的代谢汇集调控
（Gap1/Wap1/Agp1/Bap2/Bap3/Tat2—氨基酸通透酶；ARO9/ARO8/Bat1/Twt1/Bat2/TwT2—转氨酶；ARO10/PDC1/PDC5/PDC6/THI3—苯丙酮酸脱羧酶；Adh1/2/3/4/5—醇脱氢酶；Sfa1—醛脱氢酶）
2.2 莽草酸/苯丙酮酸途径莽草酸/苯丙酮酸途径是酵母等微生物中重新合成2-PE的途径。该途径将碳水化合物代谢与芳醇族化合物合成研究起来，其中包括3种芳醇族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和其他芳醇族次级代谢物。最先葡萄糖经过糖酵解途径和磷酸戊糖途径被转化为磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖，这两种物资再经过4步酶促反应转化为莽草酸，接着莽草酸经过代谢转化为苯丙酮酸。苯丙酮酸随后如艾氏途径所述（图1）通过脱羧和脱氢被转化为2-PE。米曲霉、马克念念克鲁维酵母和酿酒酵母等均施展出具故意用葡萄糖合成2-PE的材干，然则由于其生物合成途径复杂，代谢岔路多且存在多种反馈遏制因子，2-PE的产量很低。在滋长条目下，芳醇族氨基酸的胞内浓度足以使苯丙氨酸和酪氨酸明锐的同工酶基本上失活。因此，寻找大约增多L-Phe或苯丙酮酸池的优质菌株是普及利用莽草酸途径合成2-PE效率的重要。
2.3 苯乙胺途径苯乙胺途径是与艾氏途径相肖似的途径，该途径最先是在酿酒酵母和米曲霉中得到研究。在该途径中，L-Phe最先被脱羧成苯乙胺，然后被氧化脱氨成苯乙酸，临了被收复成2-PE（图1）。苯乙胺途径在诸如番茄等植物中起着荒谬要紧的作用。况且，在矮牵牛花和玫瑰花瓣中如故发现了该途径的替代门径，其中L-Phe不错通过苯乙醛合酶（PAAS）一步转化为L-苯乙醛。整个这些自然途径的研究与发现为构建基因工程菌株提供了有用酶的精粹源泉。
3 普及生物合成2-苯酒精产量的战略培养基因素和培养条目对2-苯酒精的合成影响很大。为普及2-苯酒精坐褥的经济性，研究东谈主员对菌种诱变选育、基因裁剪、培养基组成优化、发酵条目优化等旧例战略进行了往常研究，并取得了很猛进展。
3.1 底盘菌株的筛选与构建2-苯酒精可由很多微生物进行合成。关联词，由于其产量仍然太低，当今并不稳当于工业化坐褥。然则对于艾氏途径和莽草酸途径的研究为利用基因裁剪等技巧普及2-PE的产量提供了广博的远景。举例：通过过量抒发ARO8和ARO10，S. cerevisiae S288在培养60 h后不错合成2.61 g/L 2-PE沈先生 探花，比原始菌株逾越36.8%。为了加速L-Phe在酿酒酵母中的转运速率，Chen等通过过量抒发MT2和S. cerevisiae YS58源泉的Gap1基因来普及芳醇族氨基酸转运体的抒发水平，2-PE产量分辨增多了26.5%和25.3%。此外，ARO80、GLN3、GAT1和CAT8等全局调控因子的引入，使2-PE产量分辨显耀增多58%、34.7%、30.6%和62%。最近，在发酵条目下，一个由L-Phe转运体Gap1、转氨酶ARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10、醇脱氢酶ADH2和谷氨酸脱氢酶GDH2拼装而成的东谈主工构建菌株S. cerevisiae YS58（G1-A8-A10-A2）-GDH在5 L发酵罐中的2-PE合成产量达到6.3 g/L（转化率为95%），表示出2-PE产业化的精粹远景。
除艾氏途径外，利用莽草酸途径重新合成2-PE相通具有要紧真义。Aoki和Uchida获取了一株经过化学诱变处理的突变株Z. rouxii NISL3355，使2-PE产量普及了约38倍。肖似地，Kim等获取了一株马克念念克鲁维酵母的抗苯丙氨酸肖似物（对氟苯丙氨酸）抗性突变体，该突变体在不添加L-Phe的情况下从20 g/L葡萄糖中不错产生1.3 g/L 2-PE。比较于传统的诱变选育等门径，通过基因工程改造对于2-PE的合成则愈加有用。最近，Daran等在酿酒酵母中过量抒发ARO4、ARO7、3ABP、TKL1、ARO10、PYK1D146N、EcaroL、ARO3K222L，并敲除aro3和aro8，最终使得2-PE的产量达到1.59 g/L。肖似地，Xu等通过过量抒发ylPAR4、ylARO10、ylARO7、ylPHA2、scARO7G141S，并敲除ylPYK，使得Y. lipolytica YL35以葡萄糖为底物不错合成2.42 g/L 2-PE，为咫尺利用莽草酸途径合成2-PE的最高产量。
自然酵母具有自然的2-PE合成途径，但发酵经由常常很长（2~4 d），这增多了树立老本和动力破钞，进一步甩手了工业化的可膨胀性。因此，除了酵母之外，大肠杆菌也取得了紧要阻碍。由于艾氏途径不完竣，野生的大肠杆菌无法合成2-PE，通过引入玫瑰源泉的PAAS基因，经过发酵48 h该克隆菌株不错产0.34 g/L 2-PE。Guo等在大肠杆菌MG1655中共抒发aro8、KDC和yigB使2-PE的产量增多到0.28 g/L。相通的，Atsumi等通过在大肠杆菌BW25113中共抒发kivD和ADH2也获取了肖似的收尾，2-PE产量最终不错达到0.88 g/L。在艾氏途径中，普及收复力NAD(P)H是合成2-PE的一个要紧因素。在全细胞转化系统中，Hwang等改日源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶引入大肠杆菌，通过氧化葡萄糖来促进NAD(P)H的再生，从而使2-PE的产量普及了3倍。在另一项研究中，改日源于枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌BW25113（31G）中过抒发，以加速收复力的再生，最终工程菌株的2-PE产量普及了250%。为了改善辅因子与收复力不及的问题，Wang等斥地了一种辅因子自食其力的系统，将谷氨酸脱氢酶与转氨酶和酒精脱氢酶偶联，可同期再生共底物（2-酮酸）和氧化收复力[NAD(P)H]，最终使生物催化效率普及了3.8倍。和酵母一样，大肠杆菌相通领有莽草酸途径，通过引入一条从L-Phe到2-PE的途径，不错使其利用葡萄糖重新合成2-PE。Guo等通过过量抒发aroGfbr、pheAfbr、kdc、yjgB和aro8等基因，最终获取不错利用葡萄糖合成1016 mg/L 2-PE的工程菌株DG02。Koma等在大肠杆菌中进一步引入了T7启动子来增强Azospirillum brasilense源泉的苯丙酮酸脱羧酶基因（ipdC）和Lactobacillus brevis源泉的酒精脱氢酶基因（adhC）的抒发，同期敲除内源的苯乙醛脱氢酶基因（feaB）。该工程菌株最终利用葡萄糖合成7.7 mmol/L（0.94 g/L）2-PE。Kang等优化了莽草酸途径中4种重要酶aroFfbr、pheAfbr、kdc和adh1的协同抒发，重组大肠杆菌不错利用葡萄糖合成285 mg/L 2-PE。
生物转化在2-PE坐褥中表示出广博的远景。关联词，和其他醇类物资一样，高浓度的2-PE对微生物细胞有一定的毒性，当发酵液中的2-PE浓度达到一定进程时，就会遏制微生物的滋长，而且2-PE和酒精合资作用产生的毒性比它们各自产生的毒性作用累加要高。2-PE的抑菌作用机理很复杂，但常常觉得主若是由其死字性情引起，而不是对特定受体的遏制。遏制作用的主要部位可能是原生质膜，影响糖类和氨基酸运载系统，此外，由于膜的通透性增多，加速了离子和小分子代谢产物跨膜向胞外扩散，烦懑了跨膜质子电势。因此，该性情导致的坐褥力受限仍然是一个显耀的瓶颈，这促使研究东谈主员去寻求性能更优的菌株。生意上用于从葡萄糖坐褥甘油的菌株Candida glycerinogenes WL2002-5施展出4 g/L的高2-PE耐受性。利用该菌株通过分批发酵不错产生5 g/L 2-PE，是咫尺使用野生型菌株合成2-PE的最高产量。另外，2-PE的坐褥如故已毕了与就地突变相联接的巨猛进展。举例，经过紫外线放射处理后，S. cerevisiae CWY13210的突变菌株与原始菌株比较，2-PE耐受性和产量分辨普及了50%和9.1%。相通，通过紫外线映照获取的S. cerevisiae BD-25-39突变体不错合成5.4 g/L 2-PE，比原始菌株普及10.2%。值得详细的是，由于2-PE具有亲脂性，仍然难以十足撤废其所引起的毒性。因此，仍然需要更有用的诱变和筛选门径。此外，引入一些耐受性因子，举例与膜相干的热休克卵白HSP12，不错保护脂质体膜的完竣性，幸免其受到不利环境的影响。
3.2 培养基因素的优化在工业发酵经由中，发酵培养基的因素对于代谢产物的效价和产率至关要紧。如上所述，氮源的利用罢免特定的限定。因此，L-Phe老是四肢独一氮源来激活艾氏途径。然则，极少的有机氮源，如酵母索取物则故意于细胞滋长而不遏制艾氏途径。真义真义的是，Barbosa等发现，通过添加极少无机氮源，如磷酸二铵（DAP），可显耀减少酒精和乙酸的形成，并增多2-PE的产量。这可能是由于氮源的加入促进了NADH的再生，但其机制仍有待进一步施展。碳源的主邀功能是保管菌株滋长并提供必要的辅因子，如2-酮酸和NADH。一般情况下，跟着碳源的增多，2-PE的产量也会增多，但这种普及是有限的。此外，不同的碳源不错篡改L-Phe的破钞百分比、2-PE和2-苯乙基繁衍物的摩尔产率。通过与果糖、蔗糖、麦芽糖和糖蜜进行比较，发现葡萄糖是S. cerevisiae CWY132合成2-PE的最适碳源。然则为了裁汰老本，低价的碳源（如粗甘油和其他工业废物）则具有更好的价值。此外，维生素和矿物资对坐褥2-PE也有很大影响。举例，与启动条目比较，K. marxianus CBS 600在发酵条目优化后需要的维生素剂量是启动条目的80倍，这标明在生物转化条目下优化后的代谢压力更大。在恶劣条目下，Ca2+和Mg2+皆不错通过增多膜巩固性来保护细胞。当MgSO4添加量增多到0.4 g/L时，2-PE产量普及了1.65倍。当KH2PO4增多到6 g/L时，2-PE的产量也出现了肖似的增多。
3.3 发酵经由参数优化一般来说，香料的合成经由对培养温度荒谬明锐。高温不错增强一些与酒精产生研究的酶的抒发，如BAT1/2。关联词，荒芜温度规模，醇类的生成量将显耀裁汰。以酿酒酵母为例，当培养温度从30 ℃增多到40 ℃时，2-PE产量下落到1/3~1/23。在20~35 ℃的培养温度下，L-Phe的破钞量在80.5%~90.1%之间变化；当温度升高到40 ℃时，L-Phe的破钞量显耀裁汰21.9%。除了温度之外，pH也和会过影响酶活性从而影响芳醇物资的产量和因素。艾氏途径中的重要酶如ARO8和ARO9是碱性上调的，而ARO10则是相反的碱性下调；因此，需门径受折中的pH来均衡整个这个词艾氏途径。此外，pH也会篡改基质的离子情景，影响吸附剂对2-PE的吸附容量。在以氨基酸为独一氮源且葡萄糖受限的有氧条目下，氨基酸主要转化为杂酸。关联词，在厌氧条目下，氨基酸险些十足转化为杂醇。杂酸（和杂醇）的散布与培养条目密切相干。基于此，Tian等在发酵培养基中加入了一些抗坏血酸以普及系统的收复水平，遏制副产物的产生。在这一更正系统中坐褥的2-PE与圭臬2-PE样品施展出最接近的香气相似性。
除培养条目外，发酵神志对2-PE产量也有影响。据文件记录，2-PE的合成经由与细胞滋长密切相干，当葡萄糖浓度荒芜一定水平时，在有氧条目下会产生多半酒精。酒精的累积对2-PE的产生有很大的协同遏制作用。为了防护发酵经由中产生比1 g/L高的酒精，Rong等利用活性干酵母坐褥2-PE。在该体系中，酵母降解酒精以提供收复力NADH，最终不错利用8 g/L的L-Phe合成7.6 g/L的2-PE。
3.4 统计实践野心鉴于培养基组成和培养条目对2-PE坐褥的影响，需要进行更合理的优化研究。连年来，统计实践野心如单因素优化、遗传算法、Box-Behnken中心组合野心、反应面法等已被往常使用（表1）。Etschmann等利用遗传算法优化了13种培养基因素和培养温度，最终，利用K. marxianus CBS 600将2-PE的产量普及了87%。Mei等给与单因素、正交野心、Box-Behnken中心组合野心和反应面法对培养基因素进行优化，利用S. cerevisiae BD将2-PE的产量由1.19 g/L普及到4.18 g/L。统计门径的给与不仅减少了职责量，而且评估了多个参数之间的相互作用，荒谬是在利用复杂的农产工业废物方面。举例，当Plackett-Burman野心、steepest ascent野心和Box-Behnken野心联接起来优化可发酵培养物的培养基因素、酸碱度和发酵时刻时，2-PE产量普及了3.3倍。
表1 基于统计野心的2-PE发酵工艺优化
农业和工业废物被觉得是复杂碳水化合物、卵白质、脂类和多样养分物资的储存库。将这些废物生物转化为升值居品，如2-PE，不仅不错防护废物处置形成的环境羞辱，还不错增多经济价值。举例，葡萄含有复杂的因素，包括糖、有机酸、酚类化合物、卵白质、维生素等，当使用它四肢碳源并供应5 g/L L-Phe时，利用K. marxianus CBS 6556不错合成0.77 g/L 2-PE。糖蜜是一种家喻户晓的工业废物，富含羼杂糖和微量元素。当使用甜菜糖蜜四肢碳源并添加7 g/L L-Phe时，利用K. marxianus CBS 600 不错合成0.89 g/L 2-PE。在使用K. marxianus ATCC 10022进行固态发酵时，以L-Phe及干燥的固体甘蔗渣为原料可合成2-PE 10.2 mg/g 。当在甘蔗糖蜜废水中添加6 g/L L-Phe时，使用微生物羼杂培养物可获取0.99 g/L 2-PE。另外，季也蒙毕赤酵母、发酵单胞菌和酿酒酵母等皆不错利用乳清培养基通过分批发酵的神志合成1.17~3.28 g/L 2-PE。香烟废物是一种家喻户晓的可再生资源，因为它含有丰富的芳醇族化合物，是合成香料的潜在前体。在不添加任何L-Phe的情况下使用酿酒酵母不错从39.28 g/L香烟废物和10 g/L葡萄糖中产生1.55 g/L 2-PE。此外，木薯废水、番茄、辣椒渣等也皆含有丰富的碳水化合物和养分物资，为2-PE的坐褥提供了可替代的底物。关联词，应该指出的是，由于这些农用工业废物中因素复杂且未知，2-PE的产量仍然很低且不巩固。
5 2-苯酒精原位产物分离技巧香料坐褥的瓶颈之一是由于其疏水性情会使得脂质膜结组成为优先联接的指标，导致跨膜梯度的崩溃，从而丧失细胞活力。不同的微生物对于香料的细胞毒性施展出不同的耐受水平。举例，2.0 g/L外源2-PE不错十足遏制马克念念克鲁维酵母的滋长；而酿酒酵母则不错耐受高达4 g/L的2-PE。为了消弱细胞毒性增多2-PE的产量，有机溶剂萃取、疏水吸附、有机浸透汽化、环糊精（CDs）络合和超临界CO2萃取等ISPR技巧已被往常用于去除发酵液中的2-PE。表2列举了已发表文件中对于原位产物分离（ISPR）技巧在2-PE坐褥中的应用。
表2 用于2-PE坐褥的不同的原位产物分离（ISPR）技巧
液-液萃取法（LLE）给与有机溶剂从有机相中汇注索取疏水产物，因其浮浅、低价、易膨胀等特色而被往常应用于香精坐褥。举例，当使用油酸四肢萃取剂时，使用酿酒酵母不错获取12.6 g/L 2-PE，与莫得使用索取技巧比较，2-PE的含量增多了8.6 g/L。用油醇四肢萃取剂，使K. marxianus CBS 600的2-PE产量普及了3倍。此外，聚丙二醇1500和1200 （PPG 1500和PPG 1200）等高分子萃取剂在2-PE分离中相通施展出精粹的萃取性能。在以PPG 1500为萃取剂的补料分批发酵中，萃取剂中的2-PE浓度荒芜22 g/L，总浓度达到7.5 g/L。当以PPG 1200为萃取剂时，有机相中2-PE含量为26.5 g/L，2-PE Ac含量为6.1 g/L，2-PE总质料浓度达到10.5 g/L。
在液-液萃取中，发酵液被泵入抽提安设以汇注回收2-PE[图3(a)]。2-PE坐褥不错得到显耀改善，但仍存在一些劣势。最先，有机溶剂会对细胞活力和代谢活性形成严重的毒性。因此，空想的萃取剂应具有精粹的生物相容性和较高的分拨总计。其次，乳状液的形成将影响液体和溶剂相的分离。临了，亦然最要紧的一丝，液-液分离系统中使用的有机溶剂，荒谬是高碳含量的有机溶剂，很难蒸发从而去除2-PE，残留的溶剂会严重影响2-PE的质料。因此，寻找合适的有机溶剂是液-液分离操作的重要。商量到2-PE的脂溶性，使用一些脂肪酸/油脂四肢萃取剂可四肢一种2-PE回收的门径。菜籽油最先被证据不错将2-PE的举座浓度普及2.7倍。此外，疏水中空纤维膜不错被用来相反催化介质中的有机溶剂，从而幸免乳状液的形成。但需要详细的是，该膜易受羞辱。
连年来，不相容离子液体（ILS）因其可忽略的蒸气压、不可燃性和高热巩固性而成为绿色非有机溶剂受到越来越多的柔和。通过对9种离子液体的生物相容性、分拨总计（Kd）和萃取效率的空洞老师，发现3种基于[NTf2]−的离子液体具有很大的普及2-PE产量的后劲。使用基于[NTf2]−的ILS，不雅察到2-PE的总产量增多了3.5倍。此外，[NTf2]−、[TCM]−和[TCB]−基离子液体不错有用地从水相中回收2-PE。
图3 应用于2-PE坐褥中的ISPR技巧
5.2 液-固萃取为了进一步普及萃取效率，研究了一种液-固萃取系统（LSE）。在这个系统中，有机溶剂被包裹到团聚物基质中，这不仅惩办了微生物毒性和乳状液的问题，而且还简化了卑劣的加工经由[图3(b)]。将癸二酸二丁酯包埋在聚乙烯的团聚物基质中后，不仅莫得形成乳状液，2-PE的产率还普及了1倍。通过将癸二酸二丁酯镶嵌到海藻酸盐微胶囊中，野心了一条将LSE体系与膜工艺相联接的新工艺。在该体系中，不会形成乳状液，使用S. cerevisiae GIV2009，最终2-PE浓度普及到5.6 g/L，比使用单相时普及了1.8 g/L。自然LSE的性能优于LLE，但溶剂固定化会增多老本，使坐褥经由复杂化。
5.3 疏水吸附原位产物吸附（ISPA）是一种常见的ISPR技巧，它使用树脂或其他吸附介质来幸免底物或产物的遏制[图3(c)]。ISPA因其操作相对浮浅、易放大、对有毒物资不解锐、易于再生和老本低而被往常应用于生物技巧经由。为了回收2-PE，东谈主们研究了多样树脂。非极性大孔树脂D101对2-PE的吸附材干较强，对L-Phe的吸附材干较低。在添加2 g/L水合树脂D101的条目下，S. cerevisiae BD可获取6.17 g/L 2-PE产量。当使用7%（干重）的交联聚苯乙烯树脂HZ818时，用S. cerevisiae P-3从12 g/L L-Phe中得到6.6 g/L 2-PE，摩尔产率为0.744，比对照普及了66.2%。当大孔树脂FD 0816四肢汇注生物转化系统的吸附剂时，摩尔产率最高，为0.90。关联词，树脂对2-PE的吸附容量很低，而且吸附经由受发酵液的影响很大。该文对几种团聚物吸附剂进行了测试，以详情具有较高采用性的吸附剂。举例：将Hytrel®8206应用于固-液两相分离生物反应器系统，在3 L的发酵体积内可获取13.7 g/L 2-PE。当给与半汇注反应器结构时，2-PE的最高浓度为20.4 g/L，水相为1.4 g/L，团聚物相为97 g/L。
5.4 其他分离技巧5.4.1 有机浸透汽化
浸透汽化是一种膜分离经由，在膜分离经由中，一层缜密的无孔膜将液体溶液从气相均分离出来。在装有聚辛基甲基硅氧烷（POMS）膜的有机浸透汽化安设中，分批培养获取了2.2 g/L和1.3 g/L的双倍2-PE浓度。关联词，这些膜很容易被羞辱，仍然需要探索更合适的膜材料。
5.4.2 与环糊精（CDs）络合
CDs是具有疏水里面和亲水外部的超分子主体化合物。家喻户晓，CDs过甚繁衍物与很多有机化合物形成包合物。在条目下，β-CD对2-PE的萃取率为1 mol/mol。
5.4.3 超临界CO2萃取
超临界流体（SCFs）具有高吸附材干、高扩散总计和低黏度等特色，被往常应用于从泥土、水和千里淀物中索取有机羞辱物。无毒和不可燃的二氧化碳（CO2）是咫尺工业中使用的最流行和的超临界流体材料。荒谬是超临界CO2在玫瑰混凝土蒸发油的索取经由中施展出优异的性能。关联词，径直利用超临界CO2萃取是不可能的，因为CO2对细胞活力有很大的影响。因此，在索取之前进行细胞分离是必要的。
小结与预测由于植物索取的局限性和化学合成工艺的劣势，生物合成2-PE受到越来越多的柔和。自然在机理毅力和普及2-PE效价方面取得了很大阻碍，但在经济上仍不具备工业化的可行性。为了将实践室研究效果转化为工业经由，底盘菌种斥地、生物经由优化和ISPR技巧野心之间的深度集成空洞斥地是必要的。
在自然界中，很多真菌不错自主合成2-PE，但产量仍然很低。代谢工程对于改善2-PE的坐褥至关要紧，它不错消弱反馈遏制，增强前体转运，普及重要酶活性，并阻挠副产物的形成。通过对2-PE合成途径的改造或引入耐受因子，采用耐受性好、产2-PE材干强的菌株可能是获取较好的2-PE坐褥候选菌株的独一途径。此外，咫尺对2-PE合成的调控机制还莫得进行潜入的研究。更好地调处艾氏途径/莽草酸途径触及的存一火字学，荒谬是酶过甚代谢诊治，是指挥进一步遗传修饰的基础。
培养基组成和培养条目对2-PE的坐褥有很大影响。从经济的角度来看，高升值居品的坐褥率和居品性量远比骨子产量要紧。关联词，培养基因素的篡改无疑会增多生物催化法合成2-PE的坐褥老本，不利于该技巧的工业化应用。因此，进一步研究利用农业或工业副居品为主要原料，如制糖工业的副居品糖蜜，不错从简坐褥老本，故意于该工艺的工业化应用。咫尺报谈的不利用原位产物分离技巧的2-PE最高坐褥率唯独0.12 g/(L·h)，为了更好地已毕2-PE生意化坐褥，更多的研究应该汇注在2-PE的坐褥率上。
ISPR技巧夙昔常应用于2-PE坐褥中，尤其是LLE和ISPA。关联词沈先生 探花，LLE系统中残留有机溶剂的去除不毛甩手了其应用。与LLE比较，ISPA具有更大的工业放大后劲。在骨子坐褥中，ISPR技巧必定会增多坐褥经由的复杂性和老本，因此，仍需进一步研究斥地更多的高容量吸附材料诓骗于完竣细胞的原位产物分离技巧，如合成团聚物。跟着生物技巧和跨学科的快速发展，给与更先进的发酵神志，如将不同的生物材料应用到微生物发酵经由中，野心使用不错同期合成并分离2-PE的新式反应器等，同期联接ISPR技巧，使用优质菌株，将进一步普及2-PE的坐褥效率。此外，对“自然”香料日益增长的需求将使得利用生物法合成2-PE的生意远景愈加广博。